Ressonância dupla elétron-elétron (DEER) em análise de estrutura de DNA - aplicações EPR (ESR)

Desde a década de 1950, quando Watson e Crick propuseram a clássica estrutura de dupla hélice do DNA, o DNA tem estado no centro da pesquisa em ciências biológicas. O número das quatro bases no DNA e sua ordem de arranjo levam à diversidade dos genes, e sua estrutura espacial afeta a expressão gênica.

Além da tradicional estrutura de dupla hélice do DNA, estudos identificaram uma estrutura especial de quatro fitas de DNA nas células humanas, o G-quadruplex, uma estrutura de alto nível formada pelo dobramento de DNA ou RNA rico em repetições em tandem de guanina (G ), que é particularmente elevado em quádruplos G de divisão rápida, são particularmente abundantes em células de divisão rápida (por exemplo, células cancerígenas). Portanto, os G-quadruplexes podem ser usados ​​como alvos de drogas na pesquisa anticâncer. O estudo da estrutura do G-quadruplex e seu modo de ligação aos agentes ligantes é importante para o diagnóstico e tratamento de células cancerígenas.

Representação esquemática da estrutura tridimensional do G-quadruplex.
Fonte da imagem: Wikipédia

Ressonância dupla elétron-elétron (DEER)

O método Pulsed Dipolar EPR (PDEPR) foi desenvolvido como uma ferramenta confiável e versátil para determinação de estrutura em biologia estrutural e química, fornecendo informações de distância em nanoescala por técnicas de PDEPR. Em estudos de estrutura G-quadruplex, a técnica DEER combinada com rotulagem de spin direcionada ao local (SDSL) pode distinguir dímeros G-quadruplex de diferentes comprimentos e revelar o padrão de ligação dos agentes de ligação G-quadruplex ao dímero.

Diferenciação de dímeros G-quadruplex de diferentes comprimentos usando a tecnologia DEER

Usando Cu(piridina)4 como um marcador de spin para medição de distância, o complexo tetragonal planar Cu(piridina)4 foi ligado covalentemente ao G-quadruplex e à distância entre dois Cu2+ paramagnéticos no monômero quaternário G empilhado π foi medido pela detecção de interações dipolo-dipolo para estudar a formação de dímero.

[Cu2+@A4] (TTLGGG) e [Cu2+@B4] (TLGGGG) são dois oligonucleotídeos com sequências diferentes, onde L denota o ligante. Os resultados DEER de [Cu2+@A4]2 e [Cu2+@B4]2 são mostrados na Figura 1 e Figura 2. A partir dos resultados DEER, pode-se obter que em dímeros [Cu2+@A4]2, a distância média de um único Cu2+ -Cu2+ é dA=2,55 nm, a extremidade 3′ do G-quadruplex forma o dímero G-quadruplex por empilhamento cauda-cauda, ​​e o eixo gz de dois rótulos de spin Cu2+ no dímero G-quadruplex está alinhado paralelamente.

A distância de empilhamento [Cu2+@A4]2 π é maior (dB-dA = 0,66 nm) em comparação com os dímeros [Cu2+@A4]2. Foi confirmado que cada monômero [Cu2+@B4] contém um tetrâmero G adicional, resultado que está totalmente de acordo com as distâncias esperadas. Assim, medições de distância pela técnica DEER podem distinguir dímeros G-quadruplex de diferentes comprimentos.

Figura 1 (A) O espectro diferencial EPR pulsado (linha preta) do dímero [Cu2+@A4]2 e sua simulação correspondente (linha vermelha) (34 GHz, 19 K); (B) Após correção de fundo, quatro fases no mapa de domínio de tempo DEER da posição do campo (linha preta) e o melhor resultado de ajuste obtido do PeldorFit (linha vermelha); (C) Distribuição de distâncias obtida utilizando PeldorFit (linha vermelha) e simulação MD (linha cinza); (D) [Cu2+ Equilíbrio entre @A4] monômero e [Cu2+@A4]2 dímero. (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Figura 2 (A) Diagramas DEER no domínio do tempo (linhas pretas) em quatro posições de campo após correção de fundo [Cu2+@B4]2 e os melhores resultados de ajuste obtidos do PeldorFit (linhas vermelhas); (B) [Cu2+@B4]; (C) Distribuição de distância obtida usando PeldorFit (linha vermelha) e simulação MD (linha cinza). (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Sondando o modo de ligação do agente de ligação do tetrâmero G ao dímero usando a técnica DEER

Muitas pequenas moléculas e complexos metálicos, com sistemas conjugados aromáticos planares e cargas positivas, podem ligar-se e estabilizar estruturas secundárias dobradas, tornando-se assim potenciais medicamentos anticancerígenos.
O cloridrato de N, N'-bis[2-(1-piperidinil)etil]3,4,9,10-perilenotetracarboxidicarbonil (PIPER) é um agente de ligação G-quadruplex bem conhecido que pode se ligar e estabilizar o quadruplex por empilhamento, e o modo de ligação do PIPER ao G-quadruplex pode ser investigado pela técnica DEER.

A Figura 3 e a Figura 4 mostram os resultados de experimentos DEER com diferentes proporções de dímero PIPER para [Cu2+@A4]2. Os resultados mostram que quando a proporção de dímero PIPER para [Cu2+@A4]2 é de 1:1 (PIPER@[Cu2+@A4]2), dP = 2,82 nm.
O aumento da distância entre Cu2+-Cu2+ em comparação com os dímeros [Cu2+@A4]2 puros (dA = 2,55 nm) indica que o PIPER forma um complexo sanduíche com o dímero, com a molécula orgânica planar interposta entre as faces 3′ dos dois G monômeros tetraméricos. Quando a proporção de PIPER para dímero [Cu2+@A4]2 é 2:1 (2PIPER@[Cu2+@A4]2), d2P = 3,21 nm.
Uma distância adicional de empilhamento π em comparação com o dímero PIPER@[Cu2+@A4]2 (dP = 2,82 nm) indica a inserção de dois ligantes PIPER no dímero G-tetrâmero organizado cauda com cauda. A técnica DEER pode revelar um novo modo de ligação do agente de ligação PIPER do tetrâmero G no dímero do tetrâmero G para formar complexos intercalados.

Figura 3 (A) Espectros dipolo DEER com diferentes proporções de PIPER e dímero [Cu2+@A4]2 (geff =2,061); (B) Modulação DEER com diferentes proporções de PIPER e [Cu2+@A4]2 dímero Profundidade; (C) Equilíbrio do dímero [Cu2+@A4]2 e PIPER@[Cu2+@A4]2, 2PIPER@[Cu2+@A4]2, PIPER@[Cu2+@A4].
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Figura 4 (A) Espectro de domínio de tempo DEER de PIPER@[Cu2+@A4]2; (B) distribuição de distância PIPER@[Cu2+@A4]2 obtida usando PeldorFit (linha vermelha) e simulação MD (linha cinza); (C) espectro de domínio de tempo DEER de 2PIPER@[Cu2+@A4]2; (D) Distribuição de distância 2PIPER@[Cu2+@A4]2 obtida usando PeldorFit (linha vermelha) e simulação MD (linha cinza).
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Espectrômetro de ressonância paramagnética de elétrons de pulso CIQTEK

O espectrômetro de ressonância paramagnética eletrônica de pulso CIQTEK EPR100 suporta tecnologia de ressonância dupla elétron-elétron e pode ser usado para estudar a localização estrutural, interpretação funcional, processos de movimento fisiológico e interpretação do mecanismo de ação de proteínas de membrana complexas, DNA, RNA, ácidos nucleicos-proteína complexos e moléculas de proteínas relacionadas que desempenham papéis importantes em várias doenças.

Espectrômetro de ressonância paramagnética de elétrons de pulso CIQTEK EPR100


Resultados do experimento DEER de CIQTEK EPR100

Resultados experimentais após processamento com DeerAnalysis