COSY vs TOCSY: Entendendo as principais diferenças e como interpretar os espectros

Para análise estrutural de moléculas orgânicas complexas e produtos naturais, experimentos de RMN de correlação escalar homonuclear 2D estão entre as ferramentas mais úteis para resolver ambiguidades causadas por sinais sobrepostos em espectros 1D.

Entre os mais amplamente utilizados ¹H-¹H experimentos de correlação, COSY e TOCSY respondem a duas perguntas diferentes, porém complementares.

COSY é usado principalmente para rastrear conectividade local próton-próton através de acoplamentos J observáveis, enquanto TOCSY estende a transferência de magnetização através de uma rede de acoplamento contínua e ajuda a identificar todos os membros observáveis do mesmo sistema de spin.

Em termos práticos, COSY ajuda a responder "Quais prótons estão acoplados uns aos outros?", enquanto TOCSY ajuda a responder "Quais prótons pertencem ao mesmo sistema de spin?"

Este artigo percorre os dois experimentos, desde os princípios da sequência de pulsos até a interpretação prática do espectro, explicando suas principais diferenças e como eles podem ser usados juntos em espectroscopia de RMN 2D.

1. Funções Principais de COSY e TOCSY

COSY, ou Espectroscopia de Correlação, e TOCSY, ou Espectroscopia de Correlação Total, ambos usam acoplamento escalar, ou acoplamento J, para fornecer informações de correlação de prótons através de ligações químicas.

No entanto, o tipo de informação estrutural que eles foram projetados para revelar é diferente.

Considere uma cadeia de prótons continuamente acoplada:

H1 → H2 → H3 → H4

COSY: Conectividade de Acoplamento Local

COSY detecta principalmente acoplamentos escalares diretamente observáveis entre pares de prótons.

As correlações mais comuns surgem de ²J_HH e ³J_HH acoplamentos, por exemplo:

H1 ↔ H2
H2 ↔ H3
H3 ↔ H4

Essas correlações aos pares permitem que os pesquisadores construam a conectividade protônica local passo a passo.

Em outras palavras, um espectro COSY é particularmente útil quando o objetivo é reconstruir a relação sequencial entre prótons vizinhos ou de outra forma detectavelmente acoplados.

Nota: As correlações COSY não se restringem a acoplamentos de duas e três ligações. Em sistemas alílicos, sistemas aromáticos ou geometrias rígidas do tipo W, um acoplamento ⁴J suficientemente forte, tipicamente maior que cerca de 1,5 Hz, também pode gerar um pico cruzado COSY. Portanto, a presença de um pico cruzado por si só não deve ser tomada como prova de que dois núcleos são diretamente adjacentes na estrutura molecular.

TOCSY: Atribuição de um Sistema de Spin Completo

O TOCSY adota uma abordagem diferente.

Através da transferência de magnetização por uma rede acoplada por J, prótons dentro do mesmo sistema de spin contínuo podem se tornar correlacionados mesmo quando dois prótons específicos não mostram um acoplamento direto forte um com o outro.

Seu objetivo principal, portanto, não é determinar a conectividade direta de cada par de prótons. Em vez disso, o TOCSY é usado para identificar e agrupar múltiplos prótons que pertencem ao mesmo sistema de spin.

Por exemplo, se H1, H2, H3 e H4 formam uma rede de acoplamento contínua, a magnetização pode se propagar através da sequência:

H1 → H2 → H3 → H4

Como resultado, correlações entre membros mais distantes do sistema podem aparecer no espectro TOCSY.

Nota: Um sistema de spin geralmente consiste em um grupo de núcleos conectados por um caminho contínuo de acoplamentos J suficientemente fortes. Se o acoplamento efetivo entre partes de uma molécula se tornar muito fraco ou estiver ausente, a transferência de magnetização pode ser interrompida. Isso pode ocorrer quando grupos são separados por um carbono quaternário, certos arranjos de heteroátomos ou geometrias com um ângulo diedro próximo a 90°, onde o acoplamento se torna muito pequeno. O resultado é a formação de sistemas de spin relativamente independentes.

2. Princípios da Sequência de Pulsos

A diferença fundamental entre COSY e TOCSY vem da maneira como a transferência de magnetização é tratada após o período de evolução indireta, t₁.

2.1 COSY

A sequência básica de pulsos COSY pode ser representada como:

90° - t₁ - 90° - Aquisição (t₂)

O primeiro pulso de 90° rotaciona a magnetização longitudinal para o plano transversal.

Durante o t₁ período de evolução, tanto o deslocamento químico quanto o acoplamento J contribuem para a evolução da coerência.

O segundo pulso de 90° produz então transferência direta de coerência.

A coerência que permanece no núcleo original contribui para o sinal diagonal durante o período de aquisição t₂, enquanto a coerência transferida para um núcleo acoplado gera um pico cruzado.

O COSY convencional, portanto, registra principalmente relações de acoplamento J direto aos pares.

No espectro, essas correlações representam comumente prótons vizinhos ou prótons geminais ligados ao mesmo carbono.

2.2 TOCSY

O TOCSY introduz um período de mistura com bloqueio de spin adicional após o período de evolução t₁.

O bloqueio de spin não é simplesmente um pulso de RF longo. Ele é geralmente implementado usando trens de pulsos compostos, como MLEV-17 ou DIPSI-2.

Durante o tempo de mistura, esses pulsos compostos geram mistura isotrópica, permitindo que a magnetização se propague através de uma rede contínua de acoplamento J.

A magnetização primeiro transfere-se entre prótons vizinhos diretamente acoplados e pode então continuar passo a passo através do sistema:

H1 → H2 → H3 → H4

Este mecanismo de retransmissão permite que o TOCSY correlacione membros mais distantes do mesmo sistema de spin.

Tempo de Mistura em TOCSY

A duração do período de bloqueio de spin é referida como tempo de mistura, e é um dos parâmetros mais importantes que controlam a profundidade da transferência de magnetização no TOCSY.

Tempo de mistura curto, por exemplo, 20 a 30 ms

A transferência de magnetização apenas começou. As correlações são dominadas por prótons acoplados próximos, portanto o espectro resultante pode assemelhar-se a um espectro COSY.

Tempo de mistura moderadamente longo, por exemplo, 60 a 100 ms

Esta é uma faixa comumente útil para muitas moléculas pequenas e produtos naturais. A magnetização tem mais tempo para se propagar através de um sistema de spin contínuo, permitindo que membros mais distantes se tornem correlacionados.

Tempos de mistura mais longos

Mais longo nem sempre é melhor.

Aumentar o tempo de mistura pode permitir que a magnetização alcance partes mais distantes da rede de acoplamento, mas os efeitos de relaxamento e relacionados a RF também se tornam cada vez mais importantes.

T₂ O relaxamento pode reduzir a intensidade do sinal, enquanto o aquecimento por RF e outros efeitos experimentais podem contribuir para a perda de sinal ou alargamento de linha. Sob algumas condições de sequência de pulsos e experimentais, períodos de mistura mais longos também podem aumentar efeitos de relaxamento indesejados ou artefatos relacionados aos pulsos.

Por esta razão, o tempo de mistura TOCSY ideal deve ser selecionado de acordo com o tamanho molecular, topologia de acoplamento, comportamento de relaxamento e o sistema de spin de interesse.

3. Como interpretar espectros COSY e TOCSY

Em um espectro 2D de ¹H-¹H, ambos os eixos representam deslocamentos químicos de prótons.

Os sinais ao longo da diagonal correspondem às ressonâncias observadas no espectro de RMN de ¹H convencional em 1D.

Os picos cruzados localizados fora da diagonal indicam que a magnetização foi transferida entre duas ressonâncias de prótons através de caminhos de acoplamento escalar.

Dependendo do experimento, essas correlações podem representar acoplamentos diretos aos pares ou conectividade dentro de um sistema de spin contínuo.

O exemplo a seguir usa acetato de n-butila para ilustrar a interpretação prática de espectros COSY e TOCSY.

3.1 COSY: Construindo a sequência de prótons passo a passo

No acetato de n-butila, o carbono da carbonila não possui próton ligado.

Também não há caminho de acoplamento de prótons contínuo observável entre o grupo metil acetila e a cadeia n-butila.

A cadeia n-butila pode, portanto, ser analisada usando uma estratégia de rastreamento passo a passo.

• Comece com o sinal de próton de campo baixo mais isolado, H2 a aproximadamente 4,0 ppm.
• Siga a linha horizontal a partir de H2 até que o pico cruzado H2 ↔ H3 seja encontrado em aproximadamente 1,6 ppm.
• Em seguida, retorne ao sinal diagonal de H3 e procure por sua próxima correlação vizinha. Isso revela o H3 ↔ H4 pico cruzado em aproximadamente 1.4 ppm.
• A partir de H4, continue o mesmo processo para identificar a correlação H4 ↔ H5 em aproximadamente 0.9 ppm.

Ao seguir esses picos cruzados pareados individuais, a sequência de conectividade de prótons local pode ser reconstruída passo a passo.

Importante, não há correlações H2 ↔ H4 ou H2 ↔ H5 significativas no espectro COSY.

Isso ilustra uma das diferenças mais importantes entre COSY e TOCSY. O COSY revela principalmente as relações de acoplamento pareadas observáveis necessárias para construir a estrutura de prótons local.

3.2 TOCSY: Usando um sinal de ancoragem para identificar todo o sistema de spin

Para um espectro TOCSY adquirido com um tempo de mistura apropriado, uma estratégia de interpretação diferente pode ser usada.

• Primeiro, selecione uma ressonância de próton isolada como um sinal de ancoragem. Neste exemplo, H2 em aproximadamente 4.0 ppm é uma âncora conveniente porque está bem separada dos outros sinais de prótons.
• Em seguida, trace uma linha horizontal no deslocamento químico de H2.
• Ao longo desta linha, o pico diagonal de H2 aparece junto com picos cruzados correlacionando H2 com H3, H4 e H5.
• Em contraste, o próton metil acetil H1 não aparece ao longo deste traço.

Esses sinais podem, portanto, ser atribuídos ao mesmo sistema de spin n-butil.

A ausência de H1 deste traço indica que o grupo metil acetil e os prótons n-butil pertencem a sistemas de spin diferentes sob estas condições.

Esta abordagem torna-se particularmente útil para moléculas mais complexas.

Em peptídeos, por exemplo, um sinal de amida NH ou um α-H pode ser usado como âncora. Em oligossacarídeos, o próton anomérico H-1 é frequentemente um sinal de ancoragem particularmente útil.

Nesses sistemas, muitas ressonâncias de prótons intermediárias podem se sobrepor dentro de uma região estreita de deslocamento químico. Uma atribuição COSY passo a passo pode, portanto, tornar-se difícil ou ser interrompida por uma sobreposição espectral severa. O TOCSY pode ajudar a contornar esse problema permitindo que as correlações se estendam por toda a rede acoplada, tornando possível classificar os sinais em sistemas de spin mesmo quando ressonâncias intermediárias individuais são difíceis de distinguir.

4. COSY vs TOCSY: Principais diferenças em resumo

COSY e TOCSY, portanto, não são experimentos concorrentes.

Eles fornecem diferentes camadas de informações estruturais e são frequentemente mais úteis quando interpretados em conjunto.

5. Perguntas Frequentes

1. Um tempo de mistura TOCSY mais longo é sempre melhor?

Não.

Para moléculas pequenas convencionais, 60 a 100 ms é frequentemente uma faixa razoável para começar os testes.

Para amostras mais complexas, pode ser útil adquirir dois conjuntos de dados para comparação, por exemplo, um tempo de mistura curto de 20 a 30 ms e um tempo de mistura relativamente longo de 80 a 100 ms.

Com um período de mistura curto, o espectro é dominado por correlações entre prótons próximos. Um período de mistura mais longo pode revelar correlações mais distantes dentro do mesmo sistema de spin.

O valor ideal, no entanto, depende de vários fatores experimentais, incluindo acoplamento J, comportamento de relaxação, solvente, temperatura, desempenho da sonda e potência de RF. O tempo de mistura deve, portanto, ser otimizado para a amostra específica e o objetivo experimental, em vez de simplesmente maximizado.

2. Se nenhum pico cruzado for observado, podemos concluir que dois prótons não são adjacentes ou relacionados?

Não.

A ausência de um pico cruzado visível não significa necessariamente que dois núcleos não estejam relacionados.

Por exemplo, de acordo com a relação de Karplus, certos ângulos diedros podem reduzir significativamente o ³ acoplamento J.

Um pico cruzado também pode ser difícil de observar se estiver próximo à diagonal e for obscurecido pelas caudas diagonais.

Prótons trocáveis podem sofrer troca química rápida, resultando em um alargamento significativo das linhas.

Em TOCSY, um tempo de mistura muito curto também pode impedir que a magnetização alcance membros mais distantes do sistema de spin.

Portanto, uma conclusão de "sem acoplamento" não deve ser baseada apenas em um pico cruzado ausente. A interpretação também deve considerar padrões de desdobramento 1D, dados complementares de RMN 2D e os parâmetros de aquisição usados para o experimento.

3. Quais são as vantagens de experimentos aprimorados por gradiente, como gCOSY e gTOCSY?

Gradientes de campo pulsado, ou PFGs, podem ser usados para selecionar caminhos específicos de transferência de coerência e suprimir alguns ruídos e artefatos de _t1.

Comparadas com certos experimentos convencionais de ciclo de fase, as sequências aprimoradas por gradiente também podem reduzir o número de varreduras necessárias.

A quantidade real de tempo de instrumento economizado depende da sequência de pulsos específica e dos parâmetros de aquisição.

A seleção por gradiente, no entanto, não pode compensar problemas experimentais fundamentais. Um shimming ruim, calibração de pulso imprecisa, supressão de solvente inadequada ou amostragem insuficiente na dimensão indireta ainda podem comprometer a qualidade espectral. Uma boa configuração experimental básica permanece essencial para obter espectros de COSY e TOCSY confiáveis.

Escolhendo entre COSY e TOCSY na prática

COSY e TOCSY formam uma das combinações mais úteis em espectroscopia de RMN 2D.

O COSY ajuda a estabelecer quais prótons mostram relações de acoplamento J diretamente observáveis, tornando-o particularmente útil para rastrear a conectividade local.

O TOCSY ajuda a determinar quais prótons pertencem ao mesmo sistema de spin, permitindo que os pesquisadores agrupem ressonâncias relacionadas mesmo quando picos intermediários individuais se sobrepõem ou prótons distantes não mostram uma forte correlação direta.

O segredo é definir a questão estrutural antes de selecionar o experimento.

Se o objetivo é rastrear uma sequência local de prótons, o COSY é frequentemente o ponto de partida natural. Se o objetivo é identificar os membros de um sistema de spin acoplado inteiro, o TOCSY pode fornecer as informações adicionais necessárias.

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Ao interpretar espectros de COSY ou TOCSY, a parte mais difícil geralmente não é coletar mais correlações, mas entender exatamente o que cada pico cruzado diz e o que ele não diz.